Interferometric beam shaping for three dimensional MINFLUX localisation microscopy

Abstract

Die genaue Beeinflussung der Form und Position von Lichtstrahlen ist für eine Vielzahl von Anwendungen, die von optischer Kommunikation über optische Fallen und Mikroskopen reicht, wichtig. Besonders in den Biowissenschaften ist die Fluoreszenzmikroskopie ein unschätzbares Werkzeug, da es die präzise Markierung biologischer Proben, seien es einzelne Proteine oder gar ganze lebende Tiere, mit Fluorophoren ermöglicht. Die Untersuchung dichter Proben mit räumlichen Strukturen unterhalb der Beugungsgrenze des Lichts von etwa 200 bis 300 Nanometern erfordert jedoch Superauflösungstechniken. Eine kürzlich vorgestellte Methode mit der Bezeichnung ``MINFLUX'' hat gezeigt, wie das Konzept der Einzelmolekül-Lokalisierung mit Hilfe von geformten Strahlen erheblich verbessert werden kann: die Position des Moleküls wird anhand der Anzahl der Photonen effizient geschätzt, die während einer iterativen Abfolge von Anregungsstrahlen, die in der Regel ein ``Nullstelle'' im Intensitätsprofil aufweisen, detektiert werden. Bemerkenswert ist, dass MINFLUX eine isotrope Präzision im einstelligen Nanometerbereich in allen drei Dimensionen (3D) erreichen kann, was jedoch axiale Ablenkung der Strahlen erfordert. Dies stellt eine technologische Herausforderung für die Realisierung eines typischen MINFLUX-Zyklus im Sub-Millisekundenbereich dar. In dieser Arbeit untersuche ich einen Ansatz zur Strahlformung, der auf schneller dynamischer Polarisationsinterferometrie basiert. Sie ermöglicht die Manipulation von Strahlformen und deren Intensitätsnullstellen, insbesondere die axiale Ablenkung der Nullstelle eines Flaschenstrahls (``bottle beam'') die auch für die 3D MINFLUX Lokalisierung verwendet werden kann. Darüber hinaus präsentiere ich eine flexible Realisierung und Charakterisierung eines solchen inteferometrischen Strahlformers, der die Strahlen vier paralleler optischer Pfade formen kann und das Anregungsmodul eines vollwertigen 3D-MINFLUX Mikroskops bildet. Die Fähigkeiten des Aufbaus werden anhand der 3D-MINFLUX-Abbildung von DNA-Origami-Strukturen und Zellkernporenkomplexen unter Verwendung neuer MINFLUX-Schemata, die verschiedene Strahlformen innerhalb eines Zyklus mischen, um die Lokalisierungspräzision zu erhöhen, sowie die gleichzeitige 3D-MINFLUX Verfolgung zweier Fluorophore durch schnelles Schalten zwischen Anregungsmustern zweier Wellenlängen demonstriert.