Injectable hyaluronic acid based hydrogels for articular cartilage repair

Abstract

Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη ενέσιμων υδροπηκτών με βάση το υαλουρονικό οξύ για την επιδιόρθωση χόνδρινων ατελειών. Οι ήδη υπάρχουσες τεχνικές για τη θεραπεία χόνδρινων ατελειών είναι επεμβατικές και παρουσιάζουν περιορισμούς σχετικά με τη γεωμετρία και το μέγεθος του τραύματος. Επομένως, υπάρχει μεγάλη ανάγκη για την ανάπτυξη μη επεμβατικών θεραπειών με βάση τις αρχές της μηχανικής ιστών. Βάσει των παραπάνω, μελετήθηκε η ανάπτυξη ενέσιμων υδροπηκτών μεθακρυλιωμένου υαλουρονικού οξέος (MeHA), που συντέθηκαν με δύο διαφορετικές μεθόδους δικτύωσης. Πιο συγκεριμένα, ένα σύστημα εκκινητών οξείδωσης-αναγωγής υπερθειικού αμμωνίου και Ν,Ν,Ν,Ν’-τετραμεθυλοδιαμίνης και ένα πεπτίδιο που διασπάται ενζυμικά από τη μεταλλοπρωτεϊνάση θεμέλιας ουσίας 7 (ΜΜP7) χρησιμοποιήθηκαν για τον σχηματισμό υδροπηκτών με βάση το μεθακρυλιωμένο υαλουρονικό οξύ. Κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης αξιολογήθηκε πειραματικά η επίδραση του μοριακού βάρους του υαλουρονικού οξέος, του βαθμού μεθακρυλίωσης, και της τροποποίησης του μεθακρυλιωμένου υαλουρονικού οξέος χρησιμοποιώντας ένα πεπτίδιο προσκόλλησης θειικής χονδροϊτίνης, ως προς τις ιδιότητες των υδροπηκτών. Όσον αφορά τη χρήση του πεπτιδίου που διασπάται ενζυμικά από τη μεταλλοπρωτεϊνάση θεμέλιας ουσίας 7 ως μέσο δικτύωσης, παρατηρήθηκε ότι με την αύξηση της συγκέντρωσης του πεπτιδίου, ο χρόνος έναρξης σχηματισμού της υδροπηκτής και ο ρυθμός διάσπασης των συντιθεμένων υδροπηκτών μειώνονται, ενώ το μέτρο αποθήκευσής τους (G’) αυξάνεται. Η χρήση του CS-MeHA ως λειτουργικό μακρομερές είχε ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση της έναρξης σχηματισμού των υδροπηκτών και τη δημιουργία μαλακών υδροπηκτών. Τέλος, η αντίδραση δικτύωσης σε θρεπτικό μέσο ανάπτυξης κυττάρων έδειξε ότι το G’ της σχηματιζόμενης υδροπηκτής αυξάνεται σε βαθμό που θα μπορούσε να ευνοήσει τη διαφοροποίηση ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (hMSCs) σε χονδροκύτταρα. Την επιτυχή ανάπτυξη ενέσιμων υδροπηκτών με χρήση πεπτιδίου που διασπάται ενζυμικά από τη μεταλλοπρωτεϊνάση θεμέλιας ουσίας 7 ως μέσο δικτύωσης, ακολούθησε η ενσωμάτωση σε αυτές ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων, ή χονδροκυττάρων, σε χαμηλή συγκέντρωση. Οι υδροπηκτές MeHA και CS-MeHA, στις οποίες ενσωματώθηκαν hMSCs, καλλιεργήθηκαν είτε σε θρεπτικό μέσο βλαστοκυττάρων (SCM), είτε σε χονδρογονικό μέσο (CiM) και εκτιμήθηκαν σχετικά με την ικανότητά τους να προάγουν τη διαφοροποίηση των hMSCs ως προς έναν χονδρογονικό και/ή υπερτροφικό φαινότυπο, καθώς και ως προς την ικανότητά τους να διατηρούν τη βιωσιμότητα των ενσωματωμένων κυττάρων. Παρατηρήθηκε ότι οι υδροπηκτές MeHA και CS-MeHA παρέχουν ένα κατάλληλο περιβάλλον για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των hMSCs. Αύξηση των χονδρογονικών δεικτών παρατηρήθηκε και στην περίπτωση των υδροπηκτών CS-MeHA υποδεικνύοντας τη θετική επίδραση του πεπτιδίου προσκόλλησης θειικής χονδροϊτίνης στη χονδρογονική διαφοροποίηση των hMSCs. Ωστόσο, η χρήση χονδρογονικού μέσου κρίθηκε απαραίτητη για την επίτευξη χονδρογένεσης πλήρους εύρους. Τέλος, υδροπηκτές MeHA, στις οποίες ενσωματώθηκαν χονδροκύτταρα, καλλιεργήθηκαν σε μια ex vivo οστεοχόνδρινη πλατφόρμα και αξιολογήθηκαν σχετικά με την ικανότητά τους να σχηματίζουν χόνδρινη εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Κατά την δέκατη τέταρτη ημέρα της ex vivo καλλιέργειας παρατηρήθηκε κατανομή γλυκοζαμινογλυκανών και ανάπτυξη συστάδων χονδροκυττάρων σε ισογενείς ομάδες τα οποία αποτελούν χαρακτηριστικό της μορφολογίας του υαλώδους χόνδρου.