Physiological and enzymatic studies of respiration in Dehalococcoides species strain CBDB1

Abstract

Die Dissertation beschreibt die physiologischen und enzymatischen Fähigkeiten von Dehalococcoides sp Stamm CBDB1. Wachstum des Stammes CBDB1 auf Grundlage von Dehalorespiration mit HCB und PeCB konnte gezeigt werden. Diese Ergebnisse stellen ein neues System für die Kultivierung von Stamm CBDB1 mit hochchlorierten Benzolen als Elektronenakzeptoren zur Verfügung. Hydrogenase und Dehalogenase sind die Schlüsselenzyme bei der Dehalorespiration. Beide Enzyme sind membrangebunden mit den katalytischen Zentren nach außen. Hydrogenaseaktivität konnte auch im Cytoplasma gemessen werden. Die Hydrogenase von Stamm CBDB1 ist sehr empfindlich gegenüber Sauerstoff, so verloren die Zellen sofort ihre Enzymaktivität, wenn sie der Luft ausgesetzt waren. Die Aktivität der reduktiven Dehalogenasen in Kulturen von Stamm CBDB1 angezüchet auf verschiedenen Chlorbenzolen weisen darauf hin, dass verschiedene Elektronenakzeptoren unter Umständen unterschiedliche reduktive Dehalogenasen induzieren. Die Dehalogenaseaktivität gemessen an ganzen Zellen mit artifiziellen Elektrondonoren lassen vermuten, dass ein Redoxpotential von ?-360 mV für die Reduktion von Chlorbenzolen benötigt wird. Auch sterische Effekte haben einem Einfluss auf die Dehalogenaseaktivität. So war die Dehalogenaseaktivität, die mit Methylviologen ( E0´=-450 mV) gemessen wurde, höher als die mit Ethylviologen ( E0´=-480 mV). Chinone scheinen als physiologische Elektronenmediatoren in der Transportkette von Stamm CBDB1 auszuscheiden, weil durch HONOQ, einen Inhibitor von Chinon abhängigen Redoxreaktionen, die Dechlorierung in intakten Zellen mit Wasserstoff als Elektronendonor nicht gehemmt werden konnte. Bei Dechlorierungsversuchen mit intakten Zellen und Wasserstoff als Elektronendonor in Gegenwart des Protonophors TCS stellte sich heraus, dass Stamm CBDB1 nicht auf einen reversen Elektronentransport angewiesen ist. 1,2,3,4-TeCB inhibierte die Dechlorierung in Zellkulturen mit Wasserstoff als Elektronendonor. Der genaue Mechanismus der Inhibition ist unbekannt. Es wird vermutet, dass 1,2,3,4-TeCB den Elektronentransport unterbricht, ohne mit der Hydrogenase oder Dehalogenase zu interagieren. Ein putatives Gencluster, bestehend aus den Strukturgenen hupS und hupL, die membrangebundene Gruppe 1 [Ni-Fe] Hydrogenasen codieren, wurde aus Stamm CBDB1 amplifiziert und sequenziert. Das Cluster enthielt außerdem hupD, ein Gen, das ein akzessorisches Protein für die Reifung der Hydrogenase codiert. Die Amplifizierung der drei Gene aus mRNA über RT-PCR bestätigte, dass das Gencluster als polycistronischer Messenger transkribiert wird. Dem amplifizierten Operon fehlte ein Gen, das für Cytochrom b codiert. Dieses Gen existiert in allen bisher bekannten membrangebundenen [Ni-Fe] Hydrogenasen, nicht aber in löslichen Hydrogenasen. Die Hydrogenaseaktivität wurde in der Membranfraktion gemessen. Ein einzigartiges hydrophobes Segment in der kleinen Untereinheit (HupS) der Hydrogenase könnte für das Anhaften an der Membran verantwortlich sein. An diesem Punkt unterscheidet sich das Hydrogenaseoperon von Stamm CBDB1 von den bisher in der Literatur beschriebenen.